2019年10月1日，5-羟（qiǎng）甲基化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研（yán）究领域（yù）取得重要（yào）进（jìn）展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的血（xuè）管并发（fā）症是导致2型糖尿（niào）病致残致（zhì）死的（de）重（chóng）要（yào）病因，一直（zhí）缺乏一种无创便捷（jié）的临床途径（jìng）实现血管并发（fā）症的（de）发生发展（zhǎn）监（jiān）测，达到早发现、早（zǎo）干预，以提高T2D病（bìng）人的整体生（shēng）活质量，减少卫生经济负担。

该研究入（rù）组了（le）62例2型糖尿病病（bìng）人，采用5hmC-Seal技术对血浆（jiāng）cfDNA中表（biǎo）观遗传标志物5hmC的分（fèn）布情（qíng）况进（jìn）行检（jiǎn）测（cè），分（fèn）析5hmC标志（zhì）物与2型糖尿（niào）病血管并发症发（fā）生发展的（de）相关（guān）性（xìng）。结果表（biǎo）明（míng）5hmC标志物的变（biàn）化与（yǔ）T2D合（hé）并（bìng）大（dà）血管/微血管事件具有相关性，主要涉及（jí）一些与血管（guǎn）生物学（xué）和糖尿（niào）病（包（bāo）括（kuò）胰（yí）岛素耐受和炎症反应）相关的基因和信号通路。该研究建立的16个基因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组合（hé）检测可以准确区分有并发症和（hé）无并发症的2型糖尿病（bìng）病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优（yōu）于传统临床（chuáng）变量例如白蛋白尿。除此之外，还建立了13个基因-5hmC标志（zhì）物组合检测（cè），可以进一步区分T2D合并（bìng）单一并发症和多种并发（fā）症[实验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显（xiǎn）优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反（fǎn）映（yìng）了T2D病人大血管/微血管并发症发生过程中（zhōng）的表观遗传变化，因而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发症（zhèng）发生和进展方面具有良好的临床应用前景（jǐng）。

本（běn）研究共纳入62例2型（xíng）糖尿病病（bìng）人，包括（kuò）没（méi）有（yǒu）血管并发症的（de）病人12例，有单一（yī）血管并发症的病人34例（24例发生大血管事（shì）件，10例发生微血（xuè）管事件），以及有多种血管并（bìng）发症的（de）病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外（wài）周（zhōu）血cfDNA中的5hmC序列，进（jìn）行二代测序，通过生物信（xìn）息学（xué）分（fèn）析（xī）找出并发症组与（yǔ）无并（bìng）发症（zhèng）组之间有显著5hmC修饰差异的基因，单（dān）一并发（fā）症（zhèng）组和多种并发症组之间有显著（zhe）5hmC修饰差异（yì）的基因。随后利用回（huí）归模（mó）型（xíng）对差异基（jī）因进一步筛选、优（yōu）化，弹性网络进一步筛选（xuǎn），计算加权平均分，最后得到一组具有高（gāo）度（dù）灵敏度和（hé）特异（yì）性的5hmC生物标记物，并（bìng）进一步在实验组（zǔ）中验证，分（fèn）析其（qí）灵敏度和特异性。并（bìng）将新（xīn）建立（lì）的5hmC标（biāo）志物基因组合的检测（cè）性（xìng）能与传统临床（chuáng）变量进行（háng）对比分析。最后对相关基因进（jìn）行了（le）信号通路分析（xī）和（hé）功能探究。

5hmC修饰水平（píng）与血管（guǎn）并发症具有（yǒu）相关（guān）性

利用逻（luó）辑回（huí）归模型对（duì）62例（lì）有并发症和无（wú）并发症2型（xíng）糖（táng）尿病病人的5hmC差异水平进行分析发（fā）现，有并发症2型（xíng）糖尿病病人的（de）622个差异修饰候选基因（包括上调（diào）和（hé）下调基因）的归一化平均数（shù）要明显高于无并发症（zhèng）的病人（P<0.001），但是单（dān）一并发症和多（duō）发（fā）并（bìng）发症病人之间（jiān）没有显著差异。

之后将有单一（yī）并发症或多种并发症（zhèng）的50例病（bìng）人用逻辑回归（guī）模（mó）型进行了对比，发现多种（zhǒng）并发症的（de）病人的153个差异修饰候选基因（包括上调和下调基因（yīn））的归一（yī）化（huà）平均（jun1）数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有（yǒu）无并发症患（huàn）者

62例2型糖尿（niào）病病人被随机分成训（xùn）练组（n=31）和测试（shì）组（n=31）。利用弹性网络筛选后（hòu）发现，16基因-5hmC标志物组合（hé）检测可以用（yòng）于区分（fèn）有并发症和无并发（fā）症的（de）2型糖（táng）尿病病（bìng）人。

基于16基（jī）因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现无并发症病人的（de）分数在训练（liàn）集（jí）和测试集中都明（míng）显低于有并发症的病（bìng）人。只考虑加权（quán）平均（jun1）分（fèn）的话，受试者工作（zuò）特（tè）征曲线（ROC）分析表明（míng）将cutoff值设置成0.5时（shí），在（zài）测试组中中的灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分（fèn）病人是单一并发症还是多（duō）种（zhǒng）并（bìng）发（fā）症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随（suí）机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹性（xìng）网络（luò）筛选后发现，13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病病人是否发生（shēng）单一并发症或（huò）多种并发症。

基于13基（jī）因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了（le）单一并发（fā）症和（hé）多种并（bìng）发症的（de）加权平均分，发（fā）现在训练集（jí）和测试集中单一（yī）并发症和多种并发症病人的分数（shù）都有明显差异。值得一（yī）提（tí）的是，有（yǒu）肾病（bìng）并发症和无（wú）肾病并发（fā）症病人的分数也有明显差异。利用加权（quán）平均分作为判断标准的（de）受试者工（gōng）作特（tè）征曲线（ROC）表明（míng），在（zài）测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特（tè）异性（xìng）为68.8%。

5hmC标（biāo）志（zhì）物与传统临床变量/危险因（yīn）子的（de）对比

我们评估了不同临（lín）床变量（liàng）/危险因子用于监测血（xuè）管并发（fā）症的灵敏度和特异性（见（jiàn）表1）。

信号通路（lù）分析和功能（néng）探究

有并发症和无并发（fā）症病人的（de）135个差异候（hòu）选基因（yīn）的功能注释分析表明，这些基因主要富集在一些经（jīng）典的（de）信号通路。错误发（fā）现（xiàn）率相关（guān）P值（zhí）位于前10%和基因（yīn）数目≥3的（de）信号通（tōng）路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导（dǎo）的信号通路（lù）与胰（yí）岛素抵抗及炎症反应相（xiàng）关，在血管生物学和糖尿病发生（shēng）发展过程中（zhōng）发挥重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编码（mǎ）基因（yīn）[泛素（sù）B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者（zhě）。在这135个（gè）差异候选基（jī）因中（zhōng）, 一（yī）些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖尿病病程（chéng）相关的倾向（xiàng），表（biǎo）明5hmC和糖尿病血管（guǎn）并发症（zhèng）之间（jiān）可（kě）能存在时间依赖性的（de）相互作用。基（jī）于纵（zòng）向时间队列的（de）大样本研究，将（jiāng）可进一步明（míng）确（què）5hmC变（biàn）化和糖尿病持（chí）续时间之间的动态关联。关于单一（yī）并（bìng）发症和（hé）多种并发症病（bìng）人（rén）的159个候选标志基因的（de）功能（néng）注释研（yán）究发（fā）现，存在细（xì）胞-细胞连接、胶原蛋白（bái）形成、新（xīn）陈代谢、细胞应激应答信号通路（lù）的（de）富（fù）集（jí），这些信号通路均与细（xì）胞（bāo）基（jī）本（běn）功能密切相关（guān）。

血管并（bìng）发症是三分（fèn）之（zhī）二糖（táng）尿病（bìng）病人的死亡（wáng）原因，若（ruò）能及早有效控制血（xuè）管（guǎn）并发症的发生，将（jiāng）极大地改善糖尿病病人的生存质量。该研究建立了（le）一（yī）种利用cfDNA进（jìn）行（háng）2型糖（táng）尿病血管并发症（zhèng）监（jiān）测的（de）无（wú）创（chuàng）便（biàn）捷（jié）方法，较（jiào）目前临床标志物能更准确地监（jiān）控（kòng）血管并发症（zhèng）的发生，从（cóng）而提示（shì）临（lín）床及早（zǎo）采（cǎi）取应（yīng）对措施，有效（xiào）控制（zhì）病情进（jìn）展。