2019年10月1日，5-羟（qiǎng）甲基化（huà）胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域（yù）取（qǔ）得重要进展。2型（xíng）糖尿病（T2D）的（de）血管并发症（zhèng）是导（dǎo）致（zhì）2型糖（táng）尿病致残致（zhì）死的重要（yào）病因，一直缺乏一种无创便（biàn）捷（jié）的（de）临床途径实（shí）现血管并发症（zhèng）的（de）发生发展监（jiān）测，达到早发现、早干预，以提高T2D病（bìng）人的整体生活质（zhì）量，减少卫（wèi）生（shēng）经济负担。

该研究入组（zǔ）了62例2型糖尿（niào）病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表（biǎo）观（guān）遗传标志物（wù）5hmC的（de）分布情（qíng）况进（jìn）行（háng）检测，分（fèn）析5hmC标志（zhì）物与2型糖（táng）尿病血管并发症发（fā）生发展的相关性。结（jié）果表明（míng）5hmC标志物（wù）的变化与T2D合并大（dà）血管/微血管（guǎn）事件具有相关性，主（zhǔ）要涉及一些与血管生物学和糖尿（niào）病（bìng）（包括胰（yí）岛（dǎo）素耐受和炎症反应）相关的基因和信号（hào）通路。该（gāi）研（yán）究建（jiàn）立的16个基因（yīn）-5hmC标志（zhì）物组合检测（cè）可以准确（què）区分有并发（fā）症和无并（bìng）发症的（de）2型（xíng）糖尿病（bìng）病人（rén）[实验（yàn）组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变量例如白蛋白尿。除此（cǐ）之外，还（hái）建立了13个基因-5hmC标（biāo）志物（wù）组合检测，可以进一（yī）步区分T2D合（hé）并单一并发症和多（duō）种并发症[实验（yàn）组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同（tóng）样明显优于其他传统（tǒng）临床变（biàn）量（liàng）。该研究得出结（jié）论，5hmC标志物（wù）反映了T2D病人大（dà）血管/微（wēi）血管并发症（zhèng）发生过（guò）程中（zhōng）的表观（guān）遗（yí）传变化，因（yīn）而5hmC-Seal检测技（jì）术在监测糖尿病血管并发症发生和进展方（fāng）面具有良好的临床（chuáng）应用前景。

本（běn）研究共纳入62例2型糖（táng）尿病（bìng）病（bìng）人，包括（kuò）没有血管（guǎn）并发症（zhèng）的病人12例，有单一血管并（bìng）发症的病人34例（24例发生大血（xuè）管事（shì）件，10例发生微血管事件（jiàn）），以及有多种血管（guǎn）并发症的病人16例。试（shì）验收集62例（lì）病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕（bǔ）获外周血（xuè）cfDNA中的5hmC序列，进行二代测序，通过生物（wù）信息学分析找出并发（fā）症组与（yǔ）无（wú）并发症（zhèng）组（zǔ）之间有显著5hmC修饰差异的基因，单一并发症组和（hé）多种并发症组之间有显著5hmC修饰差异的（de）基因（yīn）。随后利用回归（guī）模型对差异基（jī）因进（jìn）一步（bù）筛（shāi）选、优化，弹性网络进一（yī）步筛（shāi）选，计算加（jiā）权（quán）平均分，最后得到一（yī）组具有（yǒu）高度灵敏度和特异（yì）性的5hmC生物标记物，并进（jìn）一步在实验（yàn）组中验（yàn）证，分析（xī）其灵敏度（dù）和特异（yì）性。并将新建立的5hmC标（biāo）志物基因（yīn）组合的（de）检测性能与传统临床变量进行（háng）对比分析。最后对相（xiàng）关基因进（jìn）行了信号（hào）通（tōng）路分析和功能探（tàn）究。

5hmC修饰水平（píng）与血管并发症具有相关性（xìng）

利用逻辑回归模型对62例有并（bìng）发症和无并发（fā）症（zhèng）2型糖尿病（bìng）病（bìng）人的（de）5hmC差异水平进行分析发现，有并（bìng）发症2型糖（táng）尿病（bìng）病人的622个差异修饰（shì）候选基因（包（bāo）括（kuò）上调和下调基因）的归（guī）一化（huà）平均数要明显高于无并（bìng）发（fā）症（zhèng）的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和多发并发症病（bìng）人之间没有（yǒu）显著（zhe）差（chà）异（yì）。

之后将有单一并发（fā）症或多（duō）种（zhǒng）并发症的50例病人用逻（luó）辑回归模型进行（háng）了对比，发（fā）现多种并发症的（de）病人的153个差异修饰候选基（jī）因（包括上（shàng）调和（hé）下调基因）的归一化（huà）平均数（shù）要（yào）低于无并（bìng）发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可（kě）区分有无并发症患者

62例2型糖尿病病人（rén）被随机分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛选后发现，16基（jī）因-5hmC标志物组合检测可以用于区分有并发症和无并发（fā）症的2型（xíng）糖尿病（bìng）病人。

基（jī）于16基因组（zǔ）合（hé）模型（xíng） (Detection Model 1) 的加权平均分分（fèn）析（xī），发现无并发（fā）症病人的分数在训练（liàn）集和测（cè）试集中都（dōu）明显（xiǎn）低于（yú）有（yǒu）并（bìng）发症的（de）病（bìng）人。只考虑加权平均分的话，受试者工作特征曲线（ROC）分析表明（míng）将cutoff值设（shè）置成0.5时，在测（cè）试组中（zhōng）中的灵（líng）敏（mǐn）度为60%，特异（yì）性为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分病人是单一并发症还（hái）是多种（zhǒng）并发症

50例有并发症的（de）2型糖尿病病人被随机分成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利（lì）用弹性（xìng）网（wǎng）络（luò）筛（shāi）选后发现，13基因（yīn）-5hmC标（biāo）志物组（zǔ）合可（kě）以区分2型（xíng）糖尿病病（bìng）人是否发生单（dān）一并发症（zhèng）或多种并发（fā）症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症（zhèng）和多种并发（fā）症的加权平均（jun1）分，发（fā）现在（zài）训练集和测试集中单一并发症和多种并发（fā）症病人的分（fèn）数都有明显（xiǎn）差异。值得一提的（de）是，有（yǒu）肾病（bìng）并（bìng）发症和无（wú）肾病（bìng）并发症病人的（de）分数也（yě）有明显（xiǎn）差异。利用加（jiā）权（quán）平均分作为判断标（biāo）准的受试者工作特征曲（qǔ）线（ROC）表明（míng），在测试组中（zhōng）当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物（wù）与传统临（lín）床变量/危险因子的对比

我们（men）评估（gū）了不同临床变量（liàng）/危险因子用于监（jiān）测血管并（bìng）发症的灵敏度和特异性（见表（biǎo）1）。

信（xìn）号通路分析（xī）和（hé）功能探究

有并发症（zhèng）和无（wú）并发（fā）症病人的135个差异候选基因的功能注释分析表明，这些基（jī）因主要富集在（zài）一些经典的信号通路。错误发（fā）现率相关P值位（wèi）于前（qián）10%和基因数（shù）目≥3的信号通路包括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与胰（yí）岛素抵（dǐ）抗及炎症（zhèng）反应相关，在血（xuè）管生物（wù）学（xué）和糖尿病发生发展过程（chéng）中发挥重（chóng）要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明（míng），泛素编码基（jī）因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基（jī）核糖体蛋白（bái）融（róng）合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要（yào）连接者。在这135个差异（yì）候选基因中, 一些基因（yīn） （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出（chū）与糖尿（niào）病病（bìng）程相关的倾向（xiàng），表明5hmC和（hé）糖尿（niào）病（bìng）血管并（bìng）发症（zhèng）之间可能（néng）存在时间依赖性（xìng）的相互作用。基于纵（zòng）向时间队列的大样（yàng）本研究（jiū），将（jiāng）可进一步明确5hmC变化（huà）和糖（táng）尿（niào）病持续（xù）时间之（zhī）间的动态关（guān）联。关于单一并发症和多种并发症病人的159个（gè）候（hòu）选标志基因的功能注释（shì）研究发现（xiàn），存在细胞-细胞（bāo）连接、胶原（yuán）蛋白形成、新（xīn）陈代谢、细胞应激应（yīng）答信号通路的（de）富集，这些信号通路（lù）均（jun1）与细胞基本功能密（mì）切（qiē）相（xiàng）关。

血管并（bìng）发症是三分之二糖尿病（bìng）病人（rén）的死亡原（yuán）因，若能（néng）及早有效控制血管（guǎn）并（bìng）发症的发生（shēng），将（jiāng）极大地改善糖尿病病人的生存质量。该研究建立（lì）了一种利用cfDNA进行2型糖尿病血管（guǎn）并发症监测的无创便捷方（fāng）法（fǎ），较目前临床（chuáng）标志物（wù）能更准（zhǔn）确地监控血管并发症（zhèng）的发生，从而提（tí）示临（lín）床及早采取应（yīng）对措施，有效（xiào）控制病情进（jìn）展。